バングラデシュの人獣共通感染症のシミアンフォーミーウイルスは、感染と重複感染の多様なパターンを反映しています

記事全文図とデータ参照引用メトリクスライセンスの転載と許可PDF要約シミアンフォーミーウイルス（SFV）は、非ヒト霊長類（NHP）に遍在しています。 すべてのレトロウイルスと同様に、SFVの逆転写は組換えと突然変異を引き起こします。 他のサル媒介ウイルスよりも多くのヒトがSFVに感染していることが示されているため、SFVは、ヒト/ NHPインターフェースでウイルスのウイルス学および疫学を研究するための潜在的に強力なモデルです。 アジアでは、SFVは、日常生活の中で発生するマカクの咬傷や引っかき傷を介して人間に感染する可能性があります。 バングラデシュのヒト/ NHPインターフェースでのレトロウイルス伝達を特徴づけるために、ヒトとマカクの両方からのSFVgag遺伝子からの複数のプロウイルス配列を分析しました。 ここでは、人間が複数のSFV株に同時に感染する可能性があるという証拠を報告します。一部の個体は、自生のSFV株と、別の地理的地域のマカクに見られるSFVに類似した株の両方に感染します。 これらのデータは、以前の結果と組み合わせて、SFVの非居住株の導入につながるマカクの人間が促進する動きとマカクでのレトロウイルス組換えの両方がバングラデシュのヒト間のSFV多様性に寄与することを示唆しています。伝染はじめにフォーミーウイルス（FV）は、非ヒト霊長類、猫、牛、馬などの脊椎動物宿主に広く分布しているレトロウイルスのサブファミリーです。1MeieringCD、LinialML。フォーミーウイルスの疫学と感染の歴史的展望。 Clin Microbiol Rev2001; 14：165–176。 [Crossref]、[WebofScience®]、[Google Scholar] FVは、ホスト間で効率的に伝染するが、病気を引き起こすことは知られていない古代の外因性ウイルスです。泡沫状のウイルスと霊長類。 Nature2005; 434：376–380。 [Crossref]、[WebofScience®]、[Google Scholar]非ヒト霊長類（NHP）にはほぼ遍在していますが、シミアンフォーミーウイルス（SFV）はホモサピエンスに固有のものではありません。 ヒトのSFVによる人獣共通感染症は、以前にいくつかの国で検出されており、北米のNHP研究所や動物園の労働者、「サルの寺院」の労働者、ペットの飼い主、南と南東の放し飼いのマカクの周りに住む人々など、種間接触のさまざまな状況で検出されています。中央アフリカのアジアおよびブッシュミートハンター。3GessainA、Rua R、Betsem E、Turpin J、Mahieux R.HTLV-3 / 4およびヒトにおけるシミアンフォーミーレトロウイルス：発見、疫学、異種間伝播および分子ウイルス学。 Virology2013; 435：187–199。 [Crossref]、[Google Scholar]これまでに、SFVのNHPからヒトへの伝播は100人を超える人々で記録されており、他の既知のNHP媒介レトロウイルスであるサル免疫不全ウイルスの異種間伝播イベントの数をはるかに上回っています。 、サルレトロウイルスDまたはサルT細胞リンパ球向性ウイルス。3GessainA、Rua R、Betsem E、Turpin J、Mahieux R.HTLV-3 / 4およびヒトにおけるサルフォーミーレトロウイルス：発見、疫学、異種間伝播および分子ウイルス学。 Virology2013; 435：187–199。 [Crossref]、[Google Scholar]、4Khabbaz RF、Heneine W、George JRetal。サル免疫不全ウイルスによる検査技師の感染。 N Engl J Med1994; 330：172–177。 [Crossref]、[Google Scholar]、5Lerche NW、Switzer WM、Yee JLetal。非ヒト霊長類に職業的に曝露された人におけるサルD型レトロウイルスの感染の証拠。 J Virol2001; 75：1783–1789。 [Crossref]、[Google Scholar]、6Switzer WM、Bhullar V、Shanmugam Vetal。人間以外の霊長類に職業的にさらされた人に頻繁に発生するシミアンフォーミーウイルス感染。 J Virol2004; 78：2780–2789。 [Crossref]、[WebofScience®]、[Google Scholar]、7Kalish ML、Wolfe ND、Ndongmo CBetal。サル免疫不全ウイルスにさらされた中央アフリカのハンター。 Emerg Infect Dis2005; 11：1928–1930。 [Crossref]、[WebofScience®]、[Google Scholar] NHPでのSFVの蔓延と、人間とNHPの間のインターフェースの多様性と範囲を考えると、感染した個人の数は世界で数十人に達する可能性があると推定されています8Engel G、Hungerford LL、Jones-Engel Let al。リスク評価：マカクからのシミアンフォーミーウイルスの異種間伝播を予測するためのモデル（M. fascicularis）インドネシアのバリ島にある猿の寺院で人間に。 Am J Primatol2006; 68：934–948。 [Crossref]、[Google Scholar]、9Switzer WM、Shaohua T、Ahuka-Mundeke Setal。コンゴ民主共和国の女性の複数のサル種からの新しいシミアンフォーミーウイルス感染。 Retrovirology2012; 9：100。 [Crossref]、[Google Scholar]さらに、SFVに感染したヒトに関するいくつかの縦断研究は、SFVが人から人へと伝染しないことを示唆しています。泡沫状ウイルス。 AIDS Res Hum Retroviruses2007; 23：1330–1337。 [Crossref]、[WebofScience®]、[Google Scholar]このように、SFVの人獣共通感染に影響を与える要因の特徴づけは、一部のNHPウイルスが持続的な人獣共通感染症を引き起こす可能性がある方法と理由を理解するための最良の現代モデルを提供する可能性があります。 -ヒトへの感染私たちのグループは、過去6年間、感染性病原体の異種間伝播に焦点を当てて、バングラデシュにおけるヒトとNHPとのインターフェースを研究してきました。バングラデシュ、11年から2007年。 J Virol2013; 87：558–571。 [Crossref]、[Google Scholar]、12Oberste MS、Feeroz MM、Maher Ketal。ダッカ動物園で非ヒト霊長類に自然感染したピコルナウイルス感染症。 J Virol2013; 87：572–580。 [Crossref]、[Google Scholar]、13Karlsson EA、Engel GA、Feeroz MMetal。非ヒト霊長類におけるインフルエンザウイルス感染。 Emerg Infect Dis2012; 18：1672–1675。 [Crossref]、[WebofScience®]、[Google Scholar]バングラデシュは、世界で最も人口密度の高い国のXNUMXつであり、多くの都市部がNHPの生息地内またはその近くにあります。 いくつかのNHP分類群はバングラデシュ原産であり、アカゲザル（Macaca mulatta）が最も多く、広く分布しています14。バングラデシュにおけるアカゲザル（Macaca mulatta）の分布：グループ内の個体群間変動サイズと構成。 Primate Conserv2013; 26：115–124。 [Crossref]、[Google Scholar]森林生息地が減少し続けるにつれて、特に文化的態度が寛容を促進する地域では、人間が改変した生息地で、生態学的に柔軟な小さなアカゲザルが繁殖します。15FeerozMM、Soliven K、Small CTet al.Populationdynamics。アカゲザルとそれに関連する泡沫状ウイルスのバングラデシュにおける生息地。 Emerg Microbes Infect2013; 2：e29。 [Taylor＆Francis Online]、[Google Scholar]人間とアカゲザルの接触は、主にマカクが放し飼いになっているコミュニティで発生しますが、マカクの避難所となった宗教的な神社やマカクのペットの所有権によっても発生します。 さらに、バードまたはカランダールとしてさまざまに知られている遊牧民は、何世紀にもわたってこの地域を旅し、訓練されたマカクと一緒にパフォーマンスを行うことで生計を立ててきました。 アフリカとは異なり、バングラデシュではブッシュミートを探すサルの狩猟はまれであり、ミャンマーと国境を接するチッタゴンヒルトラクト地域の先住民に限定されています16。ChowdhuryMSH、Halim M、Miah Met al。バングラデシュのChittagongHillTractsにあるMro族。 Int J Biodiversity Sci Manage2007; 3：56–62。 [Taylor＆Francis Online]、[Google Scholar] SFVのNHPから人間への感染は、咬傷によって最も一般的に発生すると考えられています。 SFVは感染したサルの口腔粘膜で活発に複製し、唾液中で高濃度を達成し、ゲノムとmRNAを容易に検出できます17。MurraySM、Picker LJ、Axthelm MK、LinialML。サル免疫不全ウイルスによるフォーミーウイルス複製の組織標的の拡大-誘発された免疫抑制。 J Virol2006; 80：663–670。 [Crossref]、[Google Scholar]ただし、ホストまたはウイルスの特性がSFVの送信にどのように影響するかについてはほとんどわかっていません。 重度の咬傷でさえ確実に感染を引き起こすわけではありません。9SwitzerWM、Shaohua T、Ahuka-Mundeke Setal。コンゴ民主共和国の女性の複数のサル種からの新しいシミアンフォーミーウイルス感染。 Retrovirology2012; 9：100。 [Crossref]、[Google Scholar]逆に、感染が記録されている一部の人間は、NHPまたはNHP組織への有意な曝露を思い出しません。人獣共通感染症のSFV感染および感染に関するその他の重要な質問は未解決のままです。 たとえば、プロウイルスDNAは、SFVに感染した一部のヒトで数十年にわたって持続的に検出されます。 他の個人は、検出可能なプロウイルスDNAなしでSFVに対する抗体を開発します。 Virology2013; 435：187–199。 [Crossref]、[Google Scholar]一部の個人が感染をクリアするかどうか、または特定のウイルス株がより持続する能力があるかどうかはまだ発見されていません。 新規宿主におけるレトロウイルス株間の組換えがパンデミックウイルスの進化の前兆であったSIV / HIVと同様に、SFVがヒト宿主で組換えられるかどうかを決定するには、さらなる研究が必要です。 唾液中のSFVの濃度が人獣共通感染症に影響を与えるかどうか、またはヒトの免疫応答が感染または継続的なウイルス血症をどのように促進または防止するかを決定するために行われた研究はほとんどありません（Soliven etal。 およびMatsenet al。、unpublished）。 また、他の地理的領域や人間とマカクの接触の他の状況で収集されたデータは、人口統計学的変数とマカクと人間の行動が人間に対するマカクの攻撃の可能性にどのように寄与するかについての洞察を提供しましたが、これらの変数がレトロウイルスにどのように影響するかについては比較的ほとんど知られていません18Fuentes A、Gamerl S.インドネシアのバリにあるパダンテガルモンキーフォレストでのカニクイザル（Macaca fascicularis）と人間の観光客の間の積極的な相互作用への年齢/性別クラスによる不均衡な参加。 Am J Primatol2005; 66：197–204。 [Crossref]、[Google Scholar]ここでは、バングラデシュのいくつかの場所でのアカゲザルへの人間の曝露とSFVの感染、およびサルの飼い主の演技について説明するデータを紹介します。 他のほとんどの研究は、高度に保存されているため、ある種の感染した個体に見られるSFV変異を明らかにしない可能性がある、pol遺伝子（インテグラーゼ）の領域に焦点を合わせています。 全血から複数のクローンを取得し、SFV gag遺伝子の一部を配列決定し、polよりも選択してSFVの遺伝的変異を明らかにし、配列データを使用して、ヒトで見つかったウイルスとマカクで見つかったウイルスを比較しました。 。 人間が複数のSFV株に同時に感染する可能性があることを示します。 一部の個体は、自生の（見つかった場所で発生した）SFV株と、他の地理的地域のマカクで見つかったSFVに類似した株の両方に感染しています。 加齢は、ヒトにおける人獣共通感染症のSFV感染の重大な危険因子でした。 女性の性別とヒンズー教もリスクの増加と関連している可能性があります。 これらのデータは、以前の結果と組み合わされています15Feeroz MM、Soliven K、Small CTetal。バングラデシュにおけるアカゲザルおよび関連するフォーミーウイルスの個体群動態。 Emerg Microbes Infect2013; 2：e29。 [Taylor＆Francis Online]、[Google Scholar]は、人間が促進するマカクの動き、複数のSFV感染、レトロウイルスの組換えがすべてバングラデシュのレトロウイルスの多様性に寄与することを示唆しています。サイト（シレット、ボルミ、ダムライ、ナラヤンガンジ、チャルマグリア）、および訓練されたマカクをフィーチャーしたパフォーマンスを上演する遊牧民グループに属する209人のパフォーマンスサルの所有者。 コミュニティサイトは、マカクが自由に生息し、住民が感染性病原体の異種間伝播に関する縦断的研究に積極的に参加する場所に2007年に設立されました。 地域研究サイトに出入りする途中でサルの飼い主に出会ったとき、私たちはパフォーマンスをしているサルの飼い主を日和見的にサンプリングしました。 バングラデシュのサルのSFV多様性の分析は、コンパニオンスタディで紹介されています。15FeerozMM、Soliven K、Small CTetal。バングラデシュにおけるアカゲザルと関連するフォーミーウイルスの個体群動態。 Emerg Microbes Infect2013; 2：e29。 [Taylor＆Francis Online]、[Google Scholar]その研究のデータは、本研究で調査したマカクのSFVデータセットの一部でもあります。 ここでは、この調査に含まれるフィールドサイト（図1）について簡単に説明します。 バングラデシュの人獣共通感染症のシミアンフォーミーウイルスは、感染と同時感染の多様なパターンを反映していますJackson、Frederick A Matsen IV、Maxine L Linial、Lisa Jones-Engelhttps：//doi.org/10.1038/emi.2013.60オンライン公開：25年2019月1日図XNUMX人獣共通感染症の被験者で検出されたSFV株のサンプリング場所と多様性。 アカゲザルが放し飼いにされていたバングラデシュ全土のXNUMXつの都市サイトで、被験者にインタビューとサンプリングを行いました。 最近、これらの各サイトで、SFVのコア株がマカクで検出できることを示しました。15FeerozMM、Soliven K、Small CTetal。バングラデシュにおけるアカゲザルと関連するフォーミーウイルスの個体群動態。 Emerg Microbes Infect2013; 2：e29。 [Taylor＆Francis Online]、[Google Scholar]アカゲザルSFVコア株は、このマップ上で色分けされています。 SFVに感染していることが判明したヒト被験者（「BGH」で示される）については、全血から複数のクローンを取得し、SFVgag遺伝子の一部を配列決定しました。 配列データを使用して、ヒトで見つかったウイルスとそのサイトのマカクで見つかったウイルスを比較しました。 各BGH識別子の横にある円の色は、これらのヒトで検出されたSFV株を示しています。 被験者のうちXNUMX人が複数のSFV株に同時に感染しており、一部の個体は自生の（見つかった場所で発生した）SFV株と、他の地域のマカクで見つかったSFVに類似した株の両方に感染していることに注意してください。 nks、既知の情報源はありません。フルサイズで表示図1動物園で感染したヒト被験者で検出されたSFV株のサンプリング場所と多様性。 アカゲザルが放し飼いにされていたバングラデシュ全土のXNUMXつの都市サイトで、被験者にインタビューとサンプリングを行いました。 最近、これらの各サイトで、SFVのコア株がマカクで検出できることを示しました。15FeerozMM、Soliven K、Small CTetal。バングラデシュにおけるアカゲザルと関連するフォーミーウイルスの個体群動態。 Emerg Microbes Infect2013; 2：e29。 [Taylor＆Francis Online]、[Google Scholar]アカゲザルSFVコア株は、このマップ上で色分けされています。 SFVに感染していることが判明したヒト被験者（「BGH」で示される）については、全血から複数のクローンを取得し、SFVgag遺伝子の一部を配列決定しました。 配列データを使用して、ヒトで見つかったウイルスとそのサイトのマカクで見つかったウイルスを比較しました。 各BGH識別子の横にある円の色は、これらのヒトで検出されたSFV株を示しています。 被験者のうちXNUMX人が複数のSFV株に同時に感染しており、一部の個体は自生の（見つかった場所で発生した）SFV株と、他の地域のマカクで見つかったSFVに類似した株の両方に感染していることに注意してください。 シレットは国の北東部に位置し、インドのアッサム州との国境から35 km以内にあり、バングラデシュでXNUMX番目に大きな都市です。 市内中心部のシャージャラル神社には約125頭のマカクが生息しています。 シレットのマカクは、神社の敷地を越えてすぐ隣の近所にまで及びます。 シャージャラルのマカクは神社のスタッフによって定期的に提供され、神社への訪問者から食べ物を受け取ることがよくあります。 神社の近くに住む50人の被験者が調査に参加しました。ボルミダッカの北約200kmにあるボルミの町では、XNUMX頭以上のアカゲザルが村全体に広がり、ヒンズー教徒とイスラム教徒の地域の間を自由に移動し、しばしば家に探しに行きます。食品の。 一部のボルミの住民は時々マカクに食べ物を提供しますが、組織的な準備はありません。 ボルミから合計105人の被験者がこの研究に参加しました。ダムライダムライの町はボルミの南西40kmに位置しています。 約75〜100頭のマカクが、ダムライを自由に通り抜けます。 マカクは、ヒンズー教の地域でより一般的に見られる、大きな日陰と果樹のある地域を好みます。 Bormiの場合と同様に、マカクの組織的なプロビジョニングはありません。 このデータセットには、ダムライの20人の被験者が含まれています。ナラヤンガンジナラヤンガンジは、ダッカの南約XNUMXkmにある人口密度の高い港湾都市です。 都市開発が緑地に取って代わるにつれて、アカゲザルの個体数はこの地域で減少し続けています。 この都市の推定60頭のマカクは準備されておらず、人間に慣れていません。 ナラヤンガンジから150人の被験者が研究に参加しました。CharmaguriaCharmaguriaはパドマ川沿いのダッカの南/南西XNUMXkmに位置しています。 この地域の200頭を超えるマカクは、中央の場所にある地元の組織によって提供されており、この小さな町の豊富な緑の地域は、動物が広く生息する自然の回廊を提供しています。 Charmaguriaからの23055人の被験者が研究に参加しました。募集、インフォームドコンセント、およびSFV陽性の個人のフォローアップを含むサンプリングプロトコルは、ワシントン大学の被験者審査委員会（XNUMX）およびバングラデシュのジャハンギルナガル大学。 人間の被験者からの生物学的および人口統計学的データは、「BanGladeshHuman」（BGH）で始まる一意の匿名の識別子でコード化されました。 各コミュニティサイトで、バングラデシュのチームメンバーは近隣のリーダーとの連絡を開始し、データ収集のためにマカクの範囲内の中心的な場所を特定しました。 その後、バングラデシュのチームメンバーは地域住民と協力し、徒歩で扇動し、マカクに噛まれたり負傷したりしたと自認する人々の参加を要請しました。 被験者の選択基準には、18歳を超える年齢、NHPへの自己申告による曝露、および/または村での長期（> 20年）居住が含まれていました。 書面によるインフォームドコンセントがすべての被験者から得られた。 人口統計データとNHP曝露を説明するデータは、現地の言語であるベンガル語でチームメンバーが実施したアンケートを通じて取得されました。 エチレンジアミン四酢酸を含むチューブに各被験者の肘前静脈から12ミリリットルの全血を採取し、氷上でXNUMX時間以内に保存し、遠心分離しました。 全血および血漿のアリコートは、分析するまで-80°Cで保存しました。 Whatman Sterile Omni Swabs（Whatman、Piscataway、NJ、USA）を使用して、口腔粘膜サンプルを採取しました。 綿棒はすぐに500µLのQiagen Buffer RLT（Qiagen、Valencia、CA、USA）に入れ、氷上で12時間以内に冷却した後、分析するまで-80°Cで凍結しました。 これらの方法は、マカクに由来する生物学的サンプルを取得して保存するために使用した方法と本質的に同じです。15FeerozMM、Soliven K、Small CTetal。バングラデシュにおけるアカゲザルと関連するフォーミーウイルスの個体群動態。 Emerg Microbes Infect2013; 2：e29。 [Taylor＆Francis Online]、[Google Scholar]確認されたSFV陽性のヒトのサンプリングを繰り返すポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって被験者がSFV陽性であることが確認された場合、研究チームは最初のサンプリングから約1年後に被験者に連絡して再サンプリングを試みました。 SFV陽性被験者のフォローアップサンプリングのための生物学的サンプル収集プロトコルは、最初のサンプリング中に使用されたものと同じでした。 さらに、SFV陽性の被験者は簡単な身体検査を受け、詳細な病歴が収集されました。アカ​​ゲザルのサンプリングこのプロジェクトのコンパニオン原稿15Feeroz MM、Soliven K、Small CTetal。アカゲザルと関連するフォーミーウイルスのバングラデシュにおける個体群動態。 Emerg Microbes Infect2013; 2：e29。 [Taylor＆Francis Online]、[Google Scholar]は、すべての動物のサンプリングと実験プロトコルを提供します。 合計184頭のアカゲザルのSFVギャグ配列が本研究に含まれています（図2）。 また、このデータセットには、最初のサンプリングからXNUMX年後に再サンプリングできたXNUMXつのアカゲザル（XNUMXつはDhamraiから、XNUMXつはBormiから）から取得したシーケンスを含めています。 バングラデシュの人獣共通感染症のシミアンフォーミーウイルスは、感染と同時感染の多様なパターンを反映していますJackson、Frederick A Matsen IV、Maxine L Linial、Lisa Jones-Engelhttps：//doi.org/10.1038/emi.2013.60オンライン公開：25年2019月2日図XNUMXサンプリング集団からのサルの血液株分類。 各サルについて、サルのサンプリング母集団に対応するカラーバーが（A）に示され、そのサルの血液サンプル内で観察された菌株に対応する色付きのタイルが（B）に示されています。 非コア株は、親株と確立された組換え関係に従ってラベル付けされます。 正の一致は、cBrother分析で90以上の隣接する塩基対の少なくとも200％の可能性によって定義されます。 少なくとも200ntのこのしきい値を超える親株に一致しないゲノムの領域は、nksとしてマークされました（既知のソースはありません）。 これは、この研究のコンパニオンペーパー、15Feeroz MM、Soliven K、Small CTetal。の図の簡略版です。バングラデシュにおけるアカゲザルと関連するフォーミーウイルスの個体群動態。 Emerg Microbes Infect2013; 2：e29。 [Taylor＆Francis Online]、[Google Scholar]、ただし系統分類が更新されています。フルサイズで表示図2サンプリング集団からのサルの血液系統分類。 各サルについて、サルのサンプリング母集団に対応するカラーバーが（A）に示され、そのサルの血液サンプル内で観察された菌株に対応する色付きのタイルが（B）に示されています。 非コア株は、親株と確立された組換え関係に従ってラベル付けされます。 正の一致は、cBrother分析で90以上の隣接する塩基対の少なくとも200％の可能性によって定義されます。 少なくとも200ntのこのしきい値を超える親株に一致しないゲノムの領域は、nksとしてマークされました（既知のソースはありません）。 これは、この研究のコンパニオンペーパー、15Feeroz MM、Soliven K、Small CTetal。の図の簡略版です。バングラデシュにおけるアカゲザルと関連するフォーミーウイルスの個体群動態。 Emerg Microbes Infect2013; 2：e29。 [Taylor＆Francis Online]、[Google Scholar]、ただし系統分類が更新されています。SFV検出ウエスタンブロットアカゲザル線維芽細胞Telo-RF細胞株19Kirchoff V、Wong S、St JS、PariGS。アカゲザルラジノウイルス（RRV）の増殖。 Arch Virol2002; 147：321–333。 [Crossref]、[GoogleScholar]はSFVMに感染しました。 ムラートまたはM。 fascicularis、または感染せずに残しました。 48時間後、細胞を1×ドデシル硫酸ナトリウムサンプルバッファー（50 mM Tris-HCl（pH 6.8）、10％グリセロール、2％ドデシル硫酸ナトリウム、5％2-メルカプトエタノール、0.01％ブロモフェノールブルー）で溶解し、サンプルを電気泳動しました。 10％ポリアクリルアミドゲルで泳動。 タンパク質をポリビニリデンジフルオリドメンブレン（Millipore Billerica、MA、USA）に転写した後、メンブレンを0.05％脱脂粉乳を含むリン酸緩衝生理食塩水+ 20％Tween-2でブロックし、水ですすぎ、乾燥させました。 それぞれが1つのレーン（分子量マーカー、非感染Telo-RFおよび感染Telo-RF細胞溶解物）を含むストリップを作成し、一次抗体（ヒト血漿）を20∶4希釈で添加し、XNUMX°Cで一晩インキュベートしました。 ストリップをリン酸緩衝生理食塩水+ 0.05％Tween-20で1回洗浄した後、二次ヤギ抗ヒト西洋ワサビペルオキシダーゼ（Thermo Scientific and GE Healthcare Rochester、NY、USA）を5000∶1希釈で室温でXNUMX時間添加しました。 。 ストリップをさらに3,3回洗浄した後、水ですすぎ、西洋ワサビペルオキシダーゼ用の5,5 '、XNUMX'-テトラメチルベンジジン安定化基質（Promega Madision、WI、USA）を適用してバンドを可視化しました。 既知のSFV陽性ヒト4Jones-EngelL、May CC、Engel GAet al.Aアジアにおける人獣共通感染症の人獣共通感染症の多様な状況、BGH20からの血漿。 Emerg Infect Dis2008; 14：1200–1208。 [Crossref]、[Google Scholar]をポジティブコントロールとして使用しました。全血からのDNA分離QIAampDNA血液ミニキット（Qiagen）を製造元のプロトコルに従って使用して、ヒトの全血から全ゲノムDNAを抽出しました。 全血200µLからDNAを抽出しました。 精製したDNAを200µLのバッファーAEで溶出しました。ゲノムDNAからのgagおよびpolフラグメントのPCR増幅合計15 µLの単離したDNAを、XNUMXラウンドPCRによるgagまたはpolフラグメントのPCR増幅に使用しました。 最初のラウンドのPCRは、gagプライマーとpolプライマーの両方を使用したマルチプレックス反応でした（プライマー配列：G1（+）（nt 114–134、SFV1GeneBank配列NC_001364NC_001736から取得）5'-AGG ATG GTG GGG ACC AGC TA-3 '; G2 （−）（nt 1451–1433）5'-CAG GAA GAG GTA CTC GGG G-3 '; P1（+）（nt 5179–5200）5'-GCC ACC CAA GGA AGT TAT GTG G-3'; P2（ −）（nt 5768–5749）5'-GCT GCC CCT TGG TCA GAG TG）-3 '。 反応物を95°Cで3分間変性させた後、95°Cで30秒間、38°Cで1分間、72°Cで1分間を25サイクル、続いて95°Cで30秒間を52サイクル行いました。 、1°Cで72分間、1°CでXNUMX分間。 ネガティブコントロールとして水を使用しました。 2 µLのPCR産物をXNUMX回目のPCRのテンプレートとして使用しました。 gagまたはpolプライマー（G3（+）（nt 190–212）5'-CAA CCT AGA TGG AGA GCT GAA GG-3 '; G4（-）（nt 1425–1406）5'-GGG GAC AAA CTA CGG CTG GG-3 '; P5（+）（nt 5339–5361）5'-TAA TCC TCC AGG GTA TCC AAA A-3'; P6（-）（nt 5728–5707）5'-ATA CCA TCG ACT ACT ACA AGG A-3 '）を使用して個々のフラグメントを増幅した。 反応物を95°Cで3分間変性させた後、35°Cで95秒間、30°Cで52分間、1°Cで72分間を1サイクル行いました。 gagおよびpolのPCR産物の予想サイズはそれぞれ1235bpsおよび390bpsです。gagフラグメントのクローニングおよび配列決定FVPCR産物は、QIAquickゲル抽出キット（Qiagen）を製造元のプロトコルに従って使用してゲル精製しました。 精製したフラグメントをTOPO-TAクローニングベクター（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）にライゲーションし、Escherichia coli TOP10コンピテントセル（Invitrogen）に形質転換しました。 各gagサンプルの複数の単一コロニーを選択し、プラスミドDNAを精製して配列決定しました。 シーケンスは、ワシントン大学ゲノミクス施設またはGeneWiz Incによって、M13フォワードおよびリバースプライマー、ならびにギャグ用の内部フォワードおよびリバースプライマーを使用して実行されました。 （米国ワシントン州シアトル）。 ウイルス株は、ヒトまたはマカクがサンプリングされた地理的部位と区別するために小文字で示されます（たとえば、Dhamraiはdhamraiコア株が検出された研究部位です）。頬スワブからのRNAの分離RLTバッファーでの凍結頬スワブサンプル（Qiagen）は、RNA抽出の直前に37 UのRNaseOUTリボヌクレアーゼ阻害剤（Invitrogen）と15UのRNaseフリーDNaseI（Promega）を用いて40°Cで1分間解凍しました。 RNeasy Mini Kit（Qiagen）を使用して、標準プロトコルに従ってトータルRNAを抽出しました。 RNAを40UのRNaseOUTと1UのRNaseフリーDNaseIで37°Cで1時間再度処理しました。 次に、サンプルを65°Cで15分間インキュベートして、酵素を不活性化しました。 RNAはその後の使用のために-20°Cで保存されました。頬スワブRNAの逆転写PCR（RT-PCR）は、頬スワブRNAから部分的なgag配列（1235 bp）をクローン化するために実行されました。 ファーストストランドcDNAは、Thermoscript RT-PCRシステム（Invitrogen）を使用して、Oligo（dT）18プライマーを使用した製造元のプロトコルに従って合成されました。 RT反応は85°Cで5分間不活化されました。 得られたcDNAは、全血FV gag増幅について上記のように3ラウンドPCRのテンプレートとして使用されました。分析クラスタリング手法と超変異分析この研究で検討中の配列は、APOBECXNUMXを介した超変異の証拠を示しました。 この活動の徹底的な分析は、Matsen etal。に示されています。 （非公開）。 この分析は、超変異の疑いのある列を削除することにより、推定上の超変異の負の配列アラインメントを生成しました。 これらのアラインメントは、超変異と本物の系統発生シグナルの混同を避けるために、この研究の残りの分析に使用されました。系統発生解析系統樹は、FastTree 2.1.7.21Price MN.DPAAPFastTreeを使用して推定上の超変異のないアラインメントから構築されました。距離行列の代わりにプロファイルを使用して大きな最小進化ツリーを計算します。 Mol Biol Evol2009; 26：1641–1650。 [Crossref]、[WebofScience®]、[Google Scholar]、22Price MN、Dehal PS、Arkin AP.FastTree2-大規模な線形のほぼ最尤ツリー。 PLoS ONE2010; 5：e9490。 [Crossref]、[WebofScience®]、[Google Scholar]このツリーは、Archeopteryx（https://sites.google.com/site/cmzmasek/home/software/archaeopteryx）を使用して視覚化されました。 同じアラインメントから、SplitsTree 4.12.823Huson DH、BryantD。進化研究における系統発生ネットワークの適用。 Mol Biol Evol2006; 23：254–267。 [Crossref]、[WebofScience®]、[Google Scholar]を使用して、分割ネットワークを作成しました。ひずみ分析ひずみは、反復再センタリングクラスタリングアルゴリズムに超変異陰性アラインメントを渡すことによって識別されました。 UCLUST v1.124Edgar RC.Searchの単一のアプリケーションは、BLASTよりも桁違いに高速であることがわかりました。 Bioinformatics2010; 26：2460–2461。 [Crossref]、[WebofScience®]、[Google Scholar]は、アルゴリズムの貪欲な性質のために、クラスタリングの結果が不十分でした。 http://drive5.com/usearch/manual/recenter.htmlでUCLUSTの作成者によって提案された反復再センタリングアルゴリズムが実装され、この問題にうまく対処しました。 クラスタリングの各ラウンドについて、前のラウンドのコンセンサス配列が、クラスターサイズの大きいものから小さいものの順に、ギャップのないアラインメントの先頭に追加されました。 この反復では、cluster_smallmemを使用してクラスタリングが実行され、新しいコンセンサス配列とクラスターが生成されました。 このプロセスをXNUMX回繰り返しました。 クラスターの割り当ては、クラスター内の他のすべてのシーケンスへの最小の平均正規化ハミング距離を持つシーケンスによって定義されるように、各クラスターの真の重心を見つけるスクリプトによってさらに微調整されました。 次に、スクリプトをチェックして、各シーケンスが最も近い重心でクラスター化されていることを確認し（ここでも、正規化されたハミング距離で定義）、必要に応じて再割り当てを行いました。この反復アルゴリズムは、97.77％のしきい値を使用して適用されました。 このしきい値は、コンパニオンスタディで使用されているしきい値よりもわずかに高いものの、15Feeroz MM、Soliven K、Small CTetal。バングラデシュにおけるアカゲザルおよび関連するフォーミーウイルスの個体群動態。 Emerg Microbes Infect2013; 2：e29。 [Taylor＆Francis Online]、[Google Scholar]は、体細胞超変異の疑いのある列を削除した結果、配列の多様性がやや少なくなったことをよりよく反映しています。 上記のように、ウイルス株は、人間またはマカクがサンプリングされた地理的サイトと区別するために小文字で示されます（たとえば、Dhamraiは、dhamraiコア株が主に発見された研究サイトです）。統計的方法人口統計学的変数の統計的分析はJMP（SAS Institute、Cary、NC、USA）統計ソフトウェアパッケージを使用して実行。 分割表の分析は、Rfisher.test関数を使用して実行されました。25Rコアチーム。 R：統計計算のための言語と環境。 ウィーン：R Foundation for Statistics Computing、2012年。[Google Scholar]結果NHP曝露を含む人口統計データ5年から2007年までの2011年間で、222人から生物学的サンプルが収集されました。

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